激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
激光扫描共聚焦显微镜的原理
从基本原理上讲，共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜，它对普通光镜从技术上作了以下几点改进：
1.用激光做光源。因为激光的单色性非常好，光源波束的波长相同，从根本上消除了色差。
2.采用共聚焦技术。在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差，并进一步消除了色差。
3.采用点扫描技术。将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像，再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的，标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
4.用计算机采集和处理光信号，并利用光电倍增管放大信号图。在共聚焦显微镜中，计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图像是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管，可以将很微弱的信号放大，灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术，可以说共聚焦显微镜是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合，是现代技术发展的必然产物。
激光扫描共聚焦显微镜原理及与普通显微镜区别示意图
激光扫描共聚焦显微镜基本操作步骤
详细操作见【Leica_TCS_SPE共聚焦显微镜操作规程.pdf】文件。
激光扫描共聚焦显微镜的应用
静态结构检测
原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构等。
1.细胞原位检测核酸
用于细胞核定位及其形态学观察以及染色体定位观察等。
2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子
利用免疫荧光标记技术或检测荧光蛋白GFP等。
3.检测细胞凋亡
检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白。
4.细胞器观察及测定
细胞器探针可以直接跨过死细胞或活细胞膜，选择性地与特定细胞器结合。
5.检测细胞融合
6.观察细胞骨架结构
7.观察细胞间缝隙连接通讯等
动态观察
活体细胞或组织功能的实时动态检测（由于仪器没有配置培养装置，只限短时间观测）。
1.实时定量测定细胞内钙离子等的变化
钙离子及其他离子浓度测定和成像。
2.测定细胞内pH变化
同一种pH荧光探针BCECF，分别用不同激发光激发得到的荧光比例，探究pH变化。
3.检测膜电位的变化
线粒体膜电位探针JC-1低电位下单体存在，发绿色荧光；高电位下J-聚集体，发红色荧光，随电位增加，红色荧光也增加。
4.检测细胞内活性氧的产生
5.检测荧光共振能量转移-FRET
利用GFP和YFP，BFP和GFP等荧光研究大分子间的相互作用。
6.检测荧光漂白恢复等
将待测细胞用荧光物质标记，淬灭；低强度激光扫描成像，非淬灭分子移动，直接反映荧光标记物质及其结合物的运动，因此可用来研究缝隙连接通讯的快慢。
激光扫描共聚焦显微镜使用注意事项
使用前请注意：
1.实验设计前请了解仪器相关配置参数，选择合适的抗体或荧光染料等。我校共聚焦显微镜激光器波长分别为405nm、488nm、532nm、635nm。同时为了避免使用冲突，请提前预约使用时间。
2.细胞样品请用0.17mm的盖玻片爬片或者用共聚焦专用培养皿培养，组织样品最后用0.17mm盖玻片封片；封片剂可用缓冲甘油或防淬灭剂等，对于活细胞，则可使其浸润于相应的溶液中，直接滴片和封片，立即观察，不加上述封片剂。
3.为了获得理想的图像，组织切片或细胞标本不能太厚及太密，并且应避免细胞重叠或杂质掩盖。
4.为保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性，非活细胞观察的样品请尽量用固定剂固定样品。
5.用前请用荧光显微镜确认一下是否有荧光，条件摸索调整合适后再使用共聚焦显微镜。
使用共聚焦显微镜时，必须注意以下几点：
1.严格按照使用规程操作，不得任意改变操作程序，激光共聚焦显微镜系统中的激光器使用寿命有限且价格昂贵。所以，在操作过程中切记，在开关的启动顺序以及在扫描过程中努力做到快速有序，保护好激光器。
2.注意不要暴露在中等功率和高功率的激光辐射中，特别要注意不得注视激光束，甚至不要观看样品；不得在系统附近储存或使用易燃易爆物的固体、液体或气体；可以引燃的材料如布或纸张不得放入光路中。
3.扫描后的图像储存在计算机内，可作进一步处理。由于计算机的硬盘有限，应及时储存到用户CD光盘上，为了防止病毒浸染，禁用U盘及移动硬盘等。
使用后注意：
及时用无水乙醇将油镜镜头擦干净，物镜镜头调至低点，将显微镜周围及房间清理干净，最后填写使用记录。
结束语
通过上述介绍，共聚焦显微镜强大的功能已可见一斑。与其他的生物学技术 (如免疫组化技术等) 相配合，它的检测范围进一步扩大。目前市场上出售的荧光探针已近 2000余种，这就使我们可利用共聚焦显微镜定性、定量地检测细胞内多种生化成分。因此共聚焦显微镜越来越成为生物医学研究人员的好帮手，随着时间的推移，它的使用会日趋广泛。