/images/logo6.jpg
 首页  中心概况  规章制度  党务行政  服务平台  科学研究  合作交流  下载专区  学校主站 
最新消息: · 仪器简介及技术参数         · 细胞培养教程         · 细胞培养技术视频         · Leica_TCS_SPE共聚焦显微镜操作规程         · 免疫组化原理应用及流程         · 荧光定量PCR原理应用及流程         · western blot原理应用及试验流程         · 共聚焦显微镜使用教程         · 流式细胞仪使用教程   
服务平台
下载专区
· 医药研究中心门卡登记表
· 研究中心从事课题研究协议书
· 研究中心入驻申请表
· 滨州医学院医药研究中心会议...
· 寒假期间实验室、仪器设备使...
· 电镜使用申请表
· 大型仪器预约申请表
文章内容页
当前位置: 首页>>服务平台>>公共科研平台>>正文

细胞培养教程
2014-09-11 15:25 张立霞 

细胞培养

细胞培养,也叫细胞克隆技术,在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术,还是其中之一的生物克隆技术来说,细胞培养都是一个必不可少的过程,细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞,这是克隆技术必不可少的环节,而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来,所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。

进行细胞培养准备:

1、细胞培养室:细胞培养室要求保持无菌操作,避免微生物及其他有害因素的影响。

2、细胞培养室必备的设备:

超净工作台台;二氧化碳培养箱;倒置显微镜;二氧化碳压缩气体;冰箱;过滤装置;离心机;高压灭菌器;酸缸;解剖显微镜;纯水\超纯水系统等。

(各设备放置的位置:超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、二氧化碳压缩气体、冰箱在超净工作室内;离心机、恒温水浴锅、冰箱在缓冲间;纯水\超纯水系统、高压灭菌器、酸缸、超声波清洗器在B403综合实验室内)

3、细胞培养室可能用到的易耗品及试剂:

玻璃器材:培养皿、滴流瓶、刻读吸管、离心管、培养瓶、烧杯量筒、三角烧瓶、血球计数板;塑料器材:多孔培养板、培养皿、培养瓶;橡皮器材:橡皮制品(最好是硅制品)做各种瓶或试管的塞子、盖子;金属器材:剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头;其他物品:无菌手套、滤器、喷壶、纱布、注射器和针头等;试剂:DMSOPBS、胰酶等。

(第一次进入细胞培养室必须自己准备的东西:拖鞋、隔离衣、手套、酒精喷壶及实验用品。

我们目前会给提供的物品:各种玻璃器皿:包括烧杯、量筒、血球计数板、玻璃培养瓶、酒精灯等;手术器械:剪刀、镊子、眼科剪、眼科镊、止血钳等;移液器、封口膜。

需要自己购置的物品:一次性塑料物品:培养瓶、培养板、一次性滤器、注射器、移液器枪头及枪头盒、离心管、冻存管、EP管等;橡皮制品(最好是硅制品)做各种瓶或试管的塞子、盖子;我们实验室没准备的一些不常用易耗品及各种试剂:酒精、DMSOPBS、胰酶、培养基、胎牛血清等。

4、进入细胞培养室的准备:

细胞培养室是独立房间,进入细胞培养室时要经过缓冲间。在进入细胞培养室前要更换拖鞋与隔离衣(经过消毒的),不进行细胞培养操作的人员请尽量不要进入细胞培养室。

 

细胞培养试剂配制

细胞的生长需要一定的营养环境,用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。液体培养基中加入一定的凝固剂(琼脂)或固体培养物(如麸皮、大米等)便成为固体培养基。固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面,在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。因此,固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造,观察,必须首先解决细胞离体培养问题,同微生物细胞培养的难易相比,比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养,特别是动物细胞的培养。

几种常用溶液的配制方法:

1、无钙、镁、离子溶液(1000ml)

氯化钠(NaCl)8g磷酸二氢钠、(NaH2PO4H20)0.05g、氯化钾(KCl)0.2g碳酸氢钠(NaHCO3)1g、柠檬酸三钠(Na3C6H5O7,H20)1g葡萄糖1g、加去离子水或双蒸水至1000mL

2、磷酸盐缓冲液:

甲液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、磷酸氢二钠(无水)28.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL

乙液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钠(无水)2.4g、氯化钠8.77g加去离子水或双蒸水至1000mL

各种浓度PB(pH=7.4)的配制:

先配 0.2M PB (pH=7.4100ml):取19ml 0.2mol/L NaH2PO4 81ml 0.2mol/L Na2HPO4, 即可。

然后 只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释 即可,如:

0.1M PBPH=7.4 :取 500ml 0.2M PB,加水稀释至 1000ml 即可。

0.01M PB PH=7.4):取50ml 0.2M PB,加水稀释至 1000ml 即可。

0.02M PB PH=7.4):取100ml 0.2 M PB,加水稀释至 1000ml 即可。 若需要 NaCl的话,加入 NaCl 0.9%g/100ml)即可。

其它各种另 PH值的 0.2M PB100ml)配方

pH       0.2M NaH2PO4ml         0.2M Na2HPO4ml

5.7             93.5                          6.5

5.8             92                             8

5.9             90                             10

6.0             87.7                          12.3

6.1             85                             15

6.2             81.5                          18.5

6.3             77.5                          22.5

6.4             73.5                          26.5

6.5             68.5                          31.5

6.6             62.5                          37.5

6.7             56.5                          43.5

6.8             51                            49

6.9             45                            55

7.0             38                            62

7.1             33                            67

7.2             28                            72

7.3             23                            77

7.4             19                            81

7.5              16                           84

7.6              13                           87

7.7              10.5                         0.5

7.8              8.5                          91.5

7.9              7                            93

8.0              5.3                          94.7

PBS简单配方:将药品(NaCl 8.0gKCl 0.2gNa2HPO4•H2O 1.56gKH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。用HClNaOHPH7.4。消毒后即可使用。

 3Hanks液:

(1)母液甲(20x)配法

NaCl(A.R)160gKCl(A.R)8gMgSO4.7H2OA.R)2gMgCl.6H2O(A.R)2g依次溶于800mL双蒸水中,前一物质溶后再加后一种。

CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL双蒸水中,溶时不断搅拌(此液应单配,单溶)。

待上述两溶液中的溶质全溶后,将它们混合,再用双蒸水补至1000mL,向其中加2mL氯仿作为防腐剂,置4保存。

(2)母液乙(20×)配法

Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04gKH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖(A.R)20.0g溶于800ml双蒸水中。

0.4%酚红液0.4g酚红放在玻璃研钵后加0.01NNaOH11.28mL,直到全部溶解,移入100mL容量瓶中,加水至100mL,过滤,pH7.44保存。

待上述各溶质完全溶解后,用双蒸水补至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐剂,置40保存。

3)使用液()配法

取母液甲和母液乙各一份,加双蒸水18份,分装后,塞好瓶塞,挂上标志。以115高压灭菌25分钟(以免葡萄糖破坏),置室温后4保存,可使用几个月。临用前,用7.5%NaHCO3调至所需pH

4D-hanks液:

甲液:NaCL:8.00g/LKCL : 0.04g/LNa2HPO4.2H2O:0.06g/LKH2PO4:0.06g/L,配500毫升;

乙液:NaHCO30.35g/L,配100毫升;

丙液:酚红:0.02g,用数滴NaHCO3溶解酚红

将乙、丙液移入甲液中。定容到1000毫升 PH值是7.4左右。分装于4下保存。

5、胰蛋白酶:

按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH7.2左右)或PBSD-hanks)液中。搅拌混匀,置于4内过夜。

胰蛋白酶不能高压消毒,其配制要在超净工作台中进行,配制后用针式滤器过滤除菌消毒。

6、青、链霉素溶液:

在超净工作台内操作,所用纯净水(双蒸水)需要高压灭菌。

青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。

使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml

1单位=1微克

注意事项:双抗配制后很容易失效,配制后的双抗分装成小管冻存至-20的冰箱内,用前提前拿出室温解冻,使用后剩余的双抗丢弃。

7HEPES溶液:

HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。

1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下:

准确称取HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4保存。

注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:称取4.766HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。

8、谷氨酰胺:

由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。

一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 

9、肝素溶液的配制:

含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml

现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为4

使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)。

10、明胶溶液:

明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制,制备过程中必须要注意无菌操作。无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液),充分摇匀,过夜放置,然后无菌分装入50ml小瓶中,4保存。

11、培养基的制备:

可以购置配制好的瓶装液体培养基,也可以购置固体培养基自行配制。

溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOHPH7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。

抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4冰箱内待用。

使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4时两周有效)。

12、血清的灭活:

细胞培养常用的是小牛血清/胎牛血清,新买来的血清要在56水浴中灭活30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。

 

细胞培养条件控制

1、温度

温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由蛋白质所需要的最适温度决定的。多数生物大分子遇到高温后容易导致空间结构改变或者丧失(变性)。细胞膜遇到高温后容易变态。在自然界,即有耐高温的细胞,也有耐低温的细胞。在极端情况下生长的生物对付极端环境的机制研究在生物进化和农业、环保、发酵工业中意义重大。

2pH

或过可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。

3、渗透压

细胞内外可溶于水的物质比例和种类决定细胞的膨胀与收缩程度,因为细胞膜是半透膜,只允许对自己有利的物质通过。同一物质在细胞内外的分布的数量不同,当某一种极溶于水的物质在细胞外浓度过大时,有可能导致细胞干瘪死亡,这些物质在细胞内过多时导致细胞过量吸水膨胀。细胞膜调节渗透压的能力是有限的。

4、营养物

营养物和水一起,又叫细胞培养液,培养液中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。营养物包括:N 源、C源,这些物质与提供能量有关;无机盐维生素、激素,这些物质与代谢调节控制有关。细胞培养液的设计一直是细胞离体培养技术的关键。理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物、调节物质的全部需要。在干细胞分化研究与应用中,关键是找到一种使干细胞分化成为所需细胞和组织的营养液。相同的人干细胞,放在不同的营养液中分化培养出人的各种脏器,这个昔日的梦想已经开始成为现实。植物细胞的组织培养技术已经基本完善配套。名贵花卉、中草药、脱毒马铃薯、组织培养莲菜苗等植物细胞与组织培养技术的不断完善,特别是由于组织培养液的商品化已经被广大农民普遍接受。

5、水

水是细胞需要数量最大的物质,不同的物种、不同部位、不同生长期的细胞含水量差别相当大。干旱植物细胞的含水量高达90%。水的需求量一般随同细胞培养液一起考虑。

6、无菌条件

体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养,但环境中(如空气)有各种其他微生物,必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养最基本的条件。

7、光

植物细胞和少数细菌需要利用光进行光合作用

8、气体

动物细胞需要不断供给氧气和排除二氧化碳,植物细胞与此相反。

 

动物细胞培养条件

 (1)血清:动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清和胎牛血清。血清提供生长必需因子,如激素、微量元素、矿物质和脂肪。有一天人们真正学会了配制和血清一样的培养液,那时血清才可被取代。在这里,血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。

(2)支持物:大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃,塑料等作为支持物。

(3)气体交换:二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节,不断维持所需要的气体条件。

注意事项:

1CO2培养箱可以提供给细胞生长所需的温度及气体条件(一般为375% CO2),在开关门的时候CO2降低的速度非常快,冬天温度降低也很快,会对里面的细胞造成损伤,所以开关门一定要迅速。

细胞不在CO2培养箱时也要尽量保证其生存条件,如进行换液时所用的完全培养基等细胞接触的液体提前放置于37水浴锅中升温至37,细胞在外界停留的时间尽量缩短等。

2、如果需要特殊的温度及气体环境,如低氧、高氧等,我们是实验室无法满足,请另想办法。

3、购置的细胞株,在购置时问好培养所需的条件、培养基和血清及其它添加物。不同的细胞株在培养时有不同的要求。

 

细胞培养分类

细胞培养方式大致可分为两种:

1、群体培养,将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中,让细胞贴壁生长,汇合后形成均匀的单细胞层

2克隆培养,将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中,各个细胞贴壁后,彼此距离较远,经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落,称为克隆。

根据培养细胞来源:

1、原代培养:从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢,而且繁殖一定的代数后(一般10代以内)停止生长,需要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。

2、细胞株:从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群,能够繁殖50代左右,在培养过程中其特征始终保持。

3细胞系:从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞,在培养条件下可无限繁殖

4、克隆:亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说,克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。

 

原代动物细胞培养注意事项:

1、实验材料要新鲜,从活体分离材料后要低温保存,并尽快进行细胞分离实验。

2无菌操作。操作时用的培养液,可加平时细胞培养液5倍含量的青链霉素

3、用酶法分离细胞时,注意酶液的浓度和控制消化时间。贴块法分离细胞时,注意动作要轻柔,不要伤到细胞组织,组织块边缘尽量平整有利于细胞游离。

4、培养液的选择。不同的细胞有对培养液中营养的要求不同,根据所分离细胞的特性选择。

 

 

 

 

关闭窗口

 

版权所有:滨州医学院医药研究中心

地址:山东省烟台市莱山区观海路346号 邮编:264003