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Leica_TCS_SPE共聚焦显微镜操作规程
2015-04-20 07:39  

激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%,使用紫外或可见光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化,成为形态学,分子生物学,神经科学,药理学,遗传学等领域中新一代的研究工具。

激光扫描共聚焦显微镜的原理

从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:

1.用激光做光源。因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。

2.采用共聚焦技术。在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差,并进一步消除了色差。

3.采用点扫描技术。将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。

4.用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图。在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。由于综合利用了以上技术,可以说共聚焦显微镜是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。

激光扫描共聚焦显微镜原理及与普通显微镜区别示意图

激光扫描共聚焦显微镜基本操作步骤

详细操作见【Leica_TCS_SPE共聚焦显微镜操作规程.pdf】文件。

激光扫描共聚焦显微镜的应用

静态结构检测

原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构等。

1.细胞原位检测核酸

用于细胞核定位及其形态学观察以及染色体定位观察等。

2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子

利用免疫荧光标记技术或检测荧光蛋白GFP等。

3.检测细胞凋亡

检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白。

4.细胞器观察及测定

细胞器探针可以直接跨过死细胞或活细胞膜,选择性地与特定细胞器结合。

5.检测细胞融合

6.观察细胞骨架结构

7.观察细胞间缝隙连接通讯等

动态观察

活体细胞或组织功能的实时动态检测(由于仪器没有配置培养装置,只限短时间观测)。

1.实时定量测定细胞内钙离子等的变化

钙离子及其他离子浓度测定和成像。

2.测定细胞内pH变化

同一种pH荧光探针BCECF,分别用不同激发光激发得到的荧光比例,探究pH变化。

3.检测膜电位的变化

线粒体膜电位探针JC-1低电位下单体存在,发绿色荧光;高电位下J-聚集体,发红色荧光,随电位增加,红色荧光也增加。

 

4.检测细胞内活性氧的产生

5.检测荧光共振能量转移-FRET

利用GFP和YFP,BFP和GFP等荧光研究大分子间的相互作用。

6.检测荧光漂白恢复等

将待测细胞用荧光物质标记,淬灭;低强度激光扫描成像,非淬灭分子移动,直接反映荧光标记物质及其结合物的运动,因此可用来研究缝隙连接通讯的快慢。

激光扫描共聚焦显微镜使用注意事项

使用前请注意:

1.实验设计前请了解仪器相关配置参数,选择合适的抗体或荧光染料等。我校共聚焦显微镜激光器波长分别为405nm488nm532nm635nm。同时为了避免使用冲突,请提前预约使用时间。

2.细胞样品请用0.17mm的盖玻片爬片或者用共聚焦专用培养皿培养,组织样品最后用0.17mm盖玻片封片;封片剂可用缓冲甘油或防淬灭剂等,对于活细胞,则可使其浸润于相应的溶液中,直接滴片和封片,立即观察,不加上述封片剂。

3.为了获得理想的图像,组织切片或细胞标本不能太厚及太密,并且应避免细胞重叠或杂质掩盖。

4.为保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性,非活细胞观察的样品请尽量用固定剂固定样品。

5.用前请用荧光显微镜确认一下是否有荧光,条件摸索调整合适后再使用共聚焦显微镜。

使用共聚焦显微镜时,必须注意以下几点:

1.严格按照使用规程操作,不得任意改变操作程序,激光共聚焦显微镜系统中的激光器使用寿命有限且价格昂贵。所以,在操作过程中切记,在开关的启动顺序以及在扫描过程中努力做到快速有序,保护好激光器。

2.注意不要暴露在中等功率和高功率的激光辐射中,特别要注意不得注视激光束,甚至不要观看样品;不得在系统附近储存或使用易燃易爆物的固体、液体或气体;可以引燃的材料如布或纸张不得放入光路中。

3.扫描后的图像储存在计算机内,可作进一步处理。由于计算机的硬盘有限,应及时储存到用户CD光盘上,为了防止病毒浸染,禁用U盘及移动硬盘等

使用后注意:

及时用无水乙醇将油镜镜头擦干净,物镜镜头调至低点,将显微镜周围及房间清理干净,最后填写使用记录。

 

结束语

通过上述介绍,共聚焦显微镜强大的功能已可见一斑。与其他的生物学技术 (如免疫组化技术等相配合,它的检测范围进一步扩大。目前市场上出售的荧光探针已近 2000余种,这就使我们可利用共聚焦显微镜定性、定量地检测细胞内多种生化成分。因此共聚焦显微镜越来越成为生物医学研究人员的好帮手,随着时间的推移,它的使用会日趋广泛。

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